融合液对延边黄牛体细胞克隆效率的影响

　  提高核移植效率是体细胞核移植技术研究的长远任务，许多技术环节仍需要改进和完善，其中重组卵母细胞的卵·核融合在体细胞核移植技术中起重要作用。在核移植技术中，融合率越高，可供培养的核移植胚胎数越多，生产出的可用胚胎数就多，核移植效率也越高。可见，重组胚的融合率直接影响着核移植效率。融合液浓度梯度融合法能有效地提高延边黄牛体细胞克隆效率。本试验是以延边黄牛耳皮肤成纤维细胞作供核细胞，利用0．28mol／L蔗糖融合液和融合液浓度梯度融合法对重组卵母细胞进行电融合操作对不同融合条件进行探究，以探寻适宜延边黄牛体细胞克隆、融合液浓度梯度融合法的最佳融合条件。

1  材料与方法

1．1  试剂及仪器

    本试验所用FBS购自鼎国生物试剂公司，其他试剂均购自Sigma公司；细胞融合仪为CRY-3型细胞电融合仪，显微操作仪为德国莱卡显微操作仪。

1．2  卵母细胞的体外成熟

    从延吉市屠宰场收集延边黄牛卵巢，置于含双抗的35—38℃生理盐水保温瓶中，4—6h内运至实验室。抽取直径为2—8 mm卵泡中的卵泡液，获取卵丘卵母细胞复合体，用冲卵液(TCM-199+5％FBS)洗净，成熟液(TCM-199+10％FBS+10 ug／mLPMSG)洗3-4遍，放人成熟液小滴中，38．5℃，5％CO2最大饱和湿度培养箱培养20—22h。

1．3  供核细胞的准备

    采集的延边黄牛耳尖部组织块进行原代培养(培养基为含15％FBS的DMEM)，待有细胞游离出来后去掉组织。将成纤维细胞与上皮细胞系进行分离纯化，成纤维细胞进行传代培养。在注核前进行血清饥饿培养，培养好的成纤维细胞用胰蛋白酶消化，待细胞收缩变圆时，加入含10％FBS的DMEM培养液终止消化。将细胞吹打成悬液，吸取沉淀细胞用显微操作液洗3遍后放入注核操作液中以供注核。

1．4  MⅡ期卵母细胞的去核、注核

    体外成熟的卵母细胞放人5 mL离心管(管内装有1 mL含3％透明脂酸酶的PBS消化液)，在漩涡混合器上混合6min。将脱掉卵丘细胞并排出第一极体的MⅡ期卵母细胞移人含5ug／mL细胞松弛素B(CB)的PBS显微操作液滴中，挤压法挤出极体及周围1／4的细胞质，完成去核，放人培养液(CRlaa+5％FBS)小滴中培养1h后将供核细胞注入到卵母细胞卵黄周隙中。放人培养液小滴中培养。

1。5  重组卵母细胞的融合

    培养2h后的显微操作重组卵用融合液1(融合液与CRlaa体积比为7：3)洗1遍，再用融合液2(融合液与CRlaa体积比为9：1)洗l遍，最后用融合液洗1遍，移人充满融合液镀银融合小室两电极间，调整卵母细胞使待融合两质膜平面与电场方向垂直。用间隔1 s、1 100—1 300 v／cm、10-80 us的1—4次直流电脉冲诱导供体细胞与去核卵母细胞融合。融合后重组胚用融合液2洗1遍，再用融合液1洗1遍，最后用CRlaa培养液洗3-4遍，放人CRlaa培养液小滴中培养1 h。未融合的弃去，选取融合和正融合的进行激活。

1．6  重组卵母细胞的激活

    融合培养1 h后的重组胚用5umol／L离子霉素预激活处理5—7 min，用2 mmol／L 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)洗3-4遍后，放入6—DMAP小滴中激活培养3—5 h。

1．7  重组胚的体外培养

    激活后用培养液(CRlaa+5％FBS+0．3％BSA)洗3—4遍，放人培养液小滴中培养。48 h观察卵裂率，每间隔48 h观察发育率。72 h更换培养液(CRIaa+5％FBS+0．3％BSA+0．3g／L GSH)，半量换液。

1．8  统计分析

    融合率二融合数／供试卵数X100％
    卵裂率二卵裂的细胞数/融合数X100％
    囊胚率二囊胚数／卵裂数X100％
    用SPSSl4．0进行统计，试验数值为平均值±标准差，方差分析多重比较检验数据差异性，显著标准为P<0．05。

2  结果

2．1  不同电场强度对重组胚融合率及体外发育率的影响

如表1所示，1 100v／cm、1 200V／CIII、1 300V／cm的融合率差异不显著，显著高于l 000 v／cm；1 100v／cm、1 200 v／cm的卵裂率显著高于1 300v／cm，他与1 000 v／cm差异不显著；1 100 v／cm、1 200v／cm的囊胚发育率显著高于1 000v／cm、1 300v／cm。结果显示，融合的适宜电场强度为1 200V／Cm。 

 2．2  不同脉冲次数对重组胚融合率及体外发育率的影响

如表2所示，使用2次、3次脉冲的融合率显著高于1次与4次脉冲差异不显著；1次、2次脉冲的卵裂率显著高于3次、4次脉冲；2次脉冲的囊胚发育率显著高于1次、3次、4次脉冲。结果显示，融合的适宜脉冲次数为2次。 

 
2．3  不同脉冲时程对重组胚融合率及体外发育率的影响

如表3所示，脉冲时程为40 lAs的融合率显著高于10 us的与20 us、80 us差异不显著；卵裂率20us、40us的显著高于10us、80us；囊胚发育率20us、40 us的显著高于10 us、80 us。结果显示，融合的适宜脉冲时程为40us。


3  讨论

    电融合是体细胞核移植生产克隆动物的关键步骤，是一个较为复杂的生理物理学变化过程，是影响重组胚体外发育的重要因素。据报道，当前世界研究最高水平的细胞融合率达到100％，这说明许多学者非常重视对细胞融合技术的研究。ZimmermannL”和Sugar等研究了细胞质膜和双层人工脂膜在电场中的行为，认为外加脉冲电场可以短暂改变细胞膜和磷脂双分子层的结构，甚至形成可以修复的明显孔洞，导致电穿孔，从而改变细胞膜的通透性，促进细胞膜内外物质的交流。当细胞与细胞之间存在紧密的膜接触时，可产生逆电压作用于细胞膜接触区，导致细胞融合。由于电融合对细胞的毒性小，重复性好而备受核移植工作者的青睐，但电融合可使一部分重构胚发生碎片化和死亡，世界上第一批克隆牛的制作过程中，体细胞的融合率接近60％，但电刺激后保持形态完好从而能够进人培养液进行培养的只占到融合总数的80％左右，相当一部分重构卵都在电融合后死掉或者发生形态异常。这和它的融合条件不无关系。因此，有必要对融合条件进行优化从而提高体细胞克隆效率。另外，由于电融合主要是依据细胞膜的流动镶嵌模型，通过直流电流使相互接触的细胞质膜产生瞬时微孔，磷脂分子发生重排，进而相互接触的细胞膜融合在一起。但当电场强度过大，微孔直径和数目超过一定限度时，会造成质膜无法修复，进而使细胞裂解。因此，融合时所使用的电场强度，对融合率及胚胎发育产生的影响，是细胞融合技术中不可忽视的环节。影响电融合的因素较多，其中脉冲时程，脉冲次数和适宜的融合液与电融合的成功率也密切相关。目前，电融合一般采用低电导的非电解质溶液。在一定渗透压和离子强度的融合液中，电压过低和脉冲时间过短不足以诱导细胞膜形成足够的孔洞，但电压过高，时程过长虽然可以暂时提高融合率，但是很快就引起细胞的退化和死亡，降低重组胚的发育能力。本研究的结果也证实了这一点。结果表明随着电场强度的不断增强，重组卵母细胞的融合率不断增加，1 300 v／cm的最高，但后期发育率则呈现下降趋势1 300v／cm的最低。在普通融合法中使用了1 100v／cm的电场强度，由于应用融合液浓度梯度融合法对重组卵母细胞起到了一定的保护作用，使细胞能够承受的电场强度增加到1 200v／cm，从而提高了重组胚的融合率，以及体细胞克隆胚的生产效率。

    本试验是在确定了适宜延边黄牛体细胞克隆的最佳融合液成分以及应用融合液浓度梯度融合法能够显著提高延边黄牛体细胞克隆效率的基础上，对融合条件进行改进，以探寻适宜融合液浓度梯度融合法的最佳融合条件，进而提高克隆效率。研究结果表明，适宜延边黄牛体细胞克隆、融合液浓度梯度融合法的融合电场强度为1 200v／cm；融合脉冲次数为2次；融合脉冲时程为40 us。