反刍动物小肽的营养研究进展

       张乃锋，王中华
   （山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018）
    摘要：肽作为蛋白质的主要消化产物，在氨基酸消化、吸收和代谢中起着重要作用。本文通过对反刍动物小肽的产生与降解、小肽的吸收与营养以及肽的调控技术等方面情况的综述为画出了当前反刍动物营养学研究领域内肽营养的研究现状与发展方向。
    关键词：反刍动物；肽；产生与降解；吸收与营养；调控技术
    中图分类号：0516文献标识码：A文章编号：1003－6377（2002）01－0006—04
    肽是蛋白质降解的中间产物。它不仅在反刍动物氨基酸消化吸收和代谢中起着重要作用，同时还是瘤胃微生物的重要营养来源，但瘤胃微生物对肽的降解却产生了过量的氨，并使这些氨经瘤胃壁排泄而损失。鉴于肽在反刍动物蛋白质营养中的特殊的调控作用，本文仅就肽的产生与降解过程、肽的吸收与营养作用机理、肽营养的调控技术作一综述。
    1 肽的产生与降解
    1.1 肽的产生
    饲料蛋白质在瘤胃通常被快速降解，优质蛋白质更是如此，并且大多数饲料蛋白质的消化过程中水解产生的寡肽占总氨基酸比例较大。研究表明瘤胃的消化过程中产生大量的肽，其量可占蛋白质、肽、氨基酸总和的80％。早期研究认为蛋白质的降解率与其可溶性成比例，后来又发现与其结构也有关系。Williams和lockburn（1991）发现酪蛋白水解迅速并造成肽的积累，但也有报道称肽积累的程度与供给蛋白质的降解速度和降解程度无关。日粮蛋白质的特性对瘤胃内容物中肽的形成数量和比例有重要影响。Asche等（1989）、Raghunath等（1987）研究采食动物性蛋白、脱脂乳、豆饼和玉米蛋白粉时，动物性蛋白、豆饼形成的可溶性蛋白质（肽类）含量高，而饲喂植物性蛋白质饲料及氨基酸平衡较差的蛋白质时，则游离氨基酸为主。Savoie等（1987）对19种动、植物性蛋白进行体外消化试验，结果动物性蛋白释放出的肽与游离氨基酸比例高于豆科蛋白，而谷物蛋白质释放量最低。试验证明必需氨基酸更易以肽或游离氨基酸的形式释放出来。水解过程中不同饲料蛋白质的肽释放量与饲料蛋白质的氨基酸组成密切相关。Meister（1987）认为必需氨基酸含量高且平衡的优质蛋白质在消化过程中容易水解生成分子量低而数量多的寡肽，而必需氨基酸缺乏且不平衡的饲料蛋白质则产生数量少、分子量大的肽片段。乐国伟等（1996）证明饲料蛋白质的寡肽释放量与有效赖氨酸（Aly）呈高度正相关。刘选珍等（1996）研究也表明饲料寡肽的量与碱性氨基酸含量相关的有效蛋白质含量呈正相关。另外，加工、贮藏条件也是影响蛋白质消化过程肽释放量与必需氨基酸比例的重要因素。
    1．2 肽的降解
   尽管多数肽类在采食1～2h后被瘤胃混合菌降解，但是不同的肽类降解速率存在较大差异（Ha et al，1991）。肽的N一端结构决定肽的降解速度。如果甘氨酸或脯氨酸出现在邻近N一端或者肽带负电荷，则肽倾向于以较慢的速度降解，表明其中有一部分肽的N一端被封锁，可能被甲酸化或乙酸化（ Wallace和Mckain，1990）。早期研究认为疏水性是肽降解速度的一个决定因素，但是这一结论在其它研究中未被证实。
   肽在瘤胃内的降解主要是由瘤胃微生物的肽酶完成（Wa11ace等，1990）。肽在瘤胃内的降解分两步完成。二肽基肽酶（dipeptidyl peptidase）将寡肽N一端依次切掉二肽，再由二肽酶（dipeptidase）将二肽断裂成氨基酸。值得注意的是，拥有高的二肽基肽酶活性的菌种是P．rumini－oola，并且它也可以降解二肽，但是肽降解模式可能随日粮与其对P．ruminicola的数量的影响而改变，如果日粮中含有大量的链球菌时，它产生的亮一氨肽酶活性占优势，肽链将以氨基酸的形式而不是二肽的形式断裂。Hino等（1987）认为原虫对肽和氨基酸的吸收有限。但Wallace等（1987，1990）发现原虫定居的动物亮一氨肽酶活性较高，并观测到原虫较细菌更活跃地摄取由两个丙氨酸（Ala）残基构成的肽。原虫对二肽的积累和水解具有重要作用，其活性随着肽链长度的增加而降低。
    2 肽的吸收与营养
    2.1 肽的吸收机制与特点
    研究表明蛋白质消化产物往往大部分是小肽而非游离氨基酸，并且小肽可能完整地被吸收进入体循环。三肽以上的寡肽一般须在肠道酶作用下水解释放游离氨基酸后才能被完整吸收。Webb（1995）发现反刍动物对小肽的吸收有两种不同的途经，即肠系膜系统和非肠系膜系统。其中空肠、回肠、盲肠和结肠所吸收的物质进入肠系膜系统，瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃和十二指肠吸收的物质进入非肠系膜系统。Dirienzo（1990）用血管瘘技术测定了绵羊氨基酸和肽的吸收，从肠系膜吸收的游离氨基酸为36．74g／d，以肽的形式吸收的氨基酸为52．01g／d，从非肠系膜吸收的量分别为4．51g／d和308．40g／d。由此可见，非肠系膜系统是肽吸收的主要途经。Matthews（ 1991）用离体瘤胃上皮细胞和瓣胃上皮细胞研究小肽的吸收情况时发现，瘤胃上皮细胞和瓣胃上皮细胞对小肽的吸收是不饱和的被动扩散过程，瓣胃上皮细胞吸收小肽的能力要强于瘤胃上皮细胞。
    小肽的吸收机制与游离氨基酸完全不同，游离氨基酸的吸收是一个主要依靠Na+泵的主动转运过程，而小肽的吸收是一个主要依靠H+或Ca+离子浓度电导而进行的消耗能量的转运过程。Bachwell（1995）已证实肠粘膜上有甘氨酸脯氨酸的寡肽转运载体。Daniel（1994）认为肽载体转运能力可能高于各种氨基酸载体转运能力的总和。小肽的吸收具有耗能低、不易饱合的特点。并且小肽与游离氨基酸的吸收机制是相互独立的，肽不影响氨基酸的吸收，氨基酸对小肽的吸收也无影响。这一机制有助于减轻由于游离氨基酸相互竞争共同吸收位点而产生的吸收抑制，可能进而影响反刍动物体内蛋白质代谢。Bamba（1992）报道，小肽作为肠腔的吸收底物，不仅增加刷状缘膜的氨基肽酶活性，而且提高二肽酶和氨基酸载体的活性和数目。在动物体内，小肽与游离氨基酸两种吸收机制对氨基酸吸收量的贡献取决于蛋白质在胃中蛋白质消化过程中释放的肽和游离氨基酸的数量比例。
    肽的吸收受许多因素的影响。Webb等（1992）研究指出，长期对大鼠限制采食（50％自由采食量）使肠组织吸收L一met及L一met－L－met的能力上升，但在仓鼠的研究中却等得出相反的结论，限制采食后肽的吸收水平下降，这可能由于载体与小肽的亲会力下降引起的。另外，肽的构型组成也影响其吸收。肽在通过小肠粘膜的转运中其构型起决定作用，肽的转运以小的二肽形式和三肽形式进行，当谷氨酸以谷氨酰胺赖氨酸形式而不是以有谷氨酸胺蛋氨酸形式利用时，大鼠小肠对其吸收速度加倍。研究还表明，当赖氨酸位于N一端与组氨酸构成二肽时，要比它位于C一端吸收速度快，而当它在C一端与谷氨酸构成二肽时，其吸收速度更迅速。
   2.2 小肽的营养作用
   2.2.1 小肽对瘤胃微生物的营养作用 Ha（1996）报道，按1：1比例给绵羊喂稻草和精料后1h，瘤胃中肽浓度增加2.5倍，然后直线下降，这一结果说明，饲料蛋白质迅速分解成肽以后，大部分被微生物利用。Arggde（1989）发现，瘤胃微生物蛋白合成所需的氨，大约有2／3来源于肽和氨基酸，即肽是瘤胃微生物合成蛋白质的重要底物。肽对瘤胃微生物生长的主要效应，是加快微生物的繁殖速度，缩短细胞分裂周期（Maeng等，1976），特别是小肽能刺激发酵糖和淀粉的微生物生长。CruzSoto等（1994）用瘤胃微生物纯培养结果表明，以可溶性糖如葡萄糖和纤维二糖作能源时，小肽促进可溶性糖分解菌的生长速度比氨基酸的促进作用高70％，而纤维素分解菌在氯化铵、混合氨基酸和肽三种氮源条件下的生长速度相同。
    目前还不清楚瘤胃微生物对小肽转运和利用的机制，但已经证明小肽是瘤胃微生物达到最大生长效率的关键因子，小肽能否促进微生物的生长，主要取决于作为能源的碳水化合物的发酵速度。对发酵速度快的可溶性糖，小肽能促进微生物的生长，而对发酵速度慢的纤维素类物质，小肽不能促进微生物的生长。这也是目前已建立的瘤胃微生物肽营养体系的核心（李利，1999）。
    2.2.2 组织对小肽的利用Pocius等(1981）观察到血液中谷胱甘肽（三肽）可被乳腺组织利用，来自谷胱甘肽的半胱氨酸可满足乳生产的需要。而其它一些研究表明，血液中游离脱氨酸不能被用来合成乳蛋白（Spies等，1975；Clark等，1978）。应用现代血管瘦技术研究证明，阉牛后肢组织能有效利用肽（Mdormickand Webb，1982）；应用纯化日粮或尿素饲喂时，肽被后肢利用的就微不足道了（Pcmilsln等，1987）Jois(1986）在泌乳牛羊和生产犊牛方面作了许多研究。他以牛生长激素（bsT）处理动物，然后检测肌肉和乳腺组织中肽氨基酸的吸收情况，结果在未处理动物中这些组织释放出肽氨基酸。这一情况表明组织对因诸如牛生长激素及其它修饰物处理而引起的代谢改变所造成的氨基酸需求的增加可由小肽来满足。因此，进一步研究反刍动物对肽、氨基酸吸收的适应机制显得十分重要，尤其在使用诸如类固醇、bsT等以改善产奶和生产性能及临时性时期更为重要。
    3 肽营养的调控技术
    通过调控措施减少肽的降解可以减少氨的损失和提高反刍动物氮的沉积效率。目前的调控措施主要是控制瘤胃内Prevotella的数量或抑制细菌对肽的吸收或通过抑制二肽酶活性封闭肽的水解。它们都有可能成为降低肽代谢浪费的有效途经，最后一种可行性最大已经证明和以找到一种异源的特异性二肽酶抑制剂（Umezawa＆Aoyagi 1983）。但尚未发现一种对二肽酶有高效特异性的抑制剂能够作为有效的体内瘤胃调控剂（Wallace＆Mckain 1996）。
   已经发现在用育肥用离子载体（如莫能菌素、tetronasin等）长时间处理时，可引起瘤胃液或体外发酵中肽的积累。但在体外试验中向瘤胃液中快速增加莫能菌素或tetronasin时对肽的降解没有影响，表明对肽代谢的抑制效果在适应一段时间后才能产生。可能是由于在与离子载体的反应中瘤胃微生物的菌种的改变引起了肽代谢的改变，相应地，P.ruminicola长时间处于离子载体中降低了膜的通透性，从而降低了肽代谢，因此改变了肽水解的特性。当前已使用的离子载体对肽的降解已经产生了影响，然而如果能发现一种专一性更强的Prevote11肽酶抑制剂则将更有效。
    据观察，瘤胃微生物肽酶活性几乎全部发生在小肽的N一端，这表明可以通过对N一端氨基酸进行化学修饰来保护肽。如乙酸化的肽在瘤胃内容物中可稳定存在达数小时，乙酸化可以使饲料或其他副产品中的快速降解肽转变为非降解蛋白质（UDP），同时它可使特定的肽通过瘤胃到达真胃，这将可能成为保护肽的一种方法。在Rowett研究所，乙酸研被用于保护肽，结果发现肽的分子量非常重要，因为一旦肽被蛋白酶（内源蛋白酶）而不是肽酶（外源蛋白酶）降解，则N一端保护就无效了。含有四个氨基酸以上的肽可通过乙酸化进行有效的保护，再大的肽则无法预测其对乙醇化作用的反应（Wallace1992）。如果经化学修饰的肽对反刍动物具有营养价值，则肽的组成氨基酸应该能被小肠吸收，并且可再用于蛋白质合成。但是N一端乙酸化可能破坏这一过程。Wallace等（1998）曾研究过乙酸化肽的肠道吸收及其营养价值。在缺乏根瘤菌的情况下用N15标记的（NH4）2SO4培养的苜蓿制备N15标记肽，普通肽通过抽提蛋白酶解物得到。把乙酸化和未修饰的肽注入绵羊空肠，回肠取样测定，结果肽的吸收率很高并且未受乙酸化影响。但Wallace等（1998）用小鼠做了饲养试验，混合的乙酸化肽导致来食量下降23％。因此，某些特定种类的肽乙酸化后可能具有高营养价值，但乙酸化肽混合物可能存在食性降低和无效利用的问题。
    另一个减缓肽代谢的方法在发现P.ruminicola的二肽酶活性能被1,10－phenanthroline快速抑制后发现。瘤胃二肽酶为金属酶，而Phanathroline为一种二价金属离子万螯合剂。同时发现原虫和其它细菌二肽酶也对phenan－throline敏感。Wallace等（1996）用体外培养细菌的方法研究了邻菲洛琳对癌胃细菌降解肽的抑制效果。癌胃Pre－votella ruminicola，Fibrobacter succinogenes, Lachnospira multipara及Megasphaera elsdenii菌的二肽酶的抑制率在95％以上。瘤胃食糜二肽酶活性降低了33％，而同一样品的混合细菌抑制率则为80％。并且五丙氨酸的降解抑制率为27％。当酪蛋白的胰蛋白酶水解产物（包括寡肽、二肽、氨基酸）与混合瘤胃液共同培养时氨和氨基酸的产量降低了71％。这说明金属离子鳌合剂抑制了瘤胃细菌寡肽和二肽酶活性，将成为控制瘤胃肽降解的有效途经。这种作用可能是抑制了二肽酶活性，但也抑制了二肽基肽酶的活性，因为它也需要金属离子作为辅助因子。另外重金属离子和phenanthroline的一些类似物都可抑制P.ruminicola。的二肽酶活性。Wallace和Mckain（1996）研究了邻菲洛琳及其他金属离子鳌合剂、对瘤胃Prevote11a ruminicola二肽酶的抑制效果。抑制效果最好的是EDTA、TPEN、TMP和邻菲洛琳，有效浓度在0.1nmol/L以及以上。在0.01 nmol/L时几乎没有抑制效果。但是他们可能会影响其它瘤胃微生物的其它活性（wallace和menken1996）。