舒巴坦对氟喹诺酮类药物体外抗菌活性的影响实验

　　随着抗生素的广泛应用，细菌的耐药菌株显著增加，成为预防和控制临床细菌感染性疾病的主要障碍。产超广谱β-内酰胺酶(Extended Spectrum β-lactamases , ESBLs)是细菌对β-内酰胺类抗生素耐药最重要的机制，它能水解氧氨基头孢菌素和氨曲南，但也能被β-内酰胺酶抑制剂所抑制。ESBLs产生的细菌，不仅对β-内酰胺环类抗生素耐药，而且也对氟喹诺酮类、氨基糖苷类、氟苯尼考、多西环素耐药，即呈多重耐药特点。将β-内酰胺环类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂舒巴坦联用，可大大提高其对产ESBLs抗菌活性。为此，本实验进一步选择了12株新近分离的鸭大肠杆菌，以研究酶抑制剂舒巴坦对抗菌药物敏感性的影响，为产ESBLs鸭大肠杆菌感染的控制提供理论依据。

一、材料与方法
　　（一）材料
　　菌株  12株鸭大肠杆菌（药理实验室分离菌株：产酶菌YC1~YC6，不产酶菌YB1~YB6，经过法国生物梅里埃VITEK32全自动细菌鉴定仪鉴定）；质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922（由中国普通微生物菌种保存中心提供，为β-内酰胺酶阴性对照菌）、肺炎克雷伯菌ATCC700603（由北京大学医学部提供，为ESBLs阳性对照菌）。
　　培养基  MH肉汤（青岛高科园海博生物有限公司，批号：20080108）、麦康凯培养基(北京环球生物有限公司，批号20081223)、MH培养基（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20080210）、GN增菌液培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：20080216）。
　　主要器材  电子分析天平、DZF-6050真空干燥箱、隔水式电热恒温培养箱、PQT-115容声冰箱、YXQG02型手提式电热压力蒸汽消毒器、90-1双向磁力搅拌器、Galanz微波炉、超净工作台、SPX-150-Z震荡培养箱。
　　药品   恩诺沙星（94%）；乳酸环丙沙星（93%）；甲替沙星（98.5%）；盐酸左氧氟沙星（89.92%）；克林沙星（90%）；阿米卡星（60%）；新霉素（85%）；头孢曲松钠（85%）；舒巴坦钠（85%），以上药品均由国产原料药。
　　（二）方法
　　1.多重耐药菌株的筛选
　　抗生素原液的配制：根据需要配制抗生素原液的浓度为512微克/毫升，称取适量药品，其中甲替沙星、恩诺沙星、克林沙星不溶于水，应用0.1摩尔/升的氢氧化钠助溶，再用高压过的蒸馏水稀释，其它几种抗生素溶于水，可在无菌操作下用用无菌蒸馏水溶解和稀释，配制成体积为10毫升的抗生素原液，分装小瓶，在4℃冰箱中保存，可用一周。
　　菌液配制：首先将标准菌株接种于新鲜肉汤培养基中，并置于37℃恒温环境培养12小时，然后接种于麦康凯琼脂平板上，置37℃培养12小时后挑取单个菌落接种5毫升的GN增菌培养液中，37℃培养12小时，使用前稀释10000倍。
　　材料：聚苯乙烯微孔板，8×12厘米大小，每块板上八横排，每排12孔，每孔0.20毫升，孔底呈v型，细菌生长时聚集于孔底，有利于结果的观察。微量移液器，规格为50-300微升，可自由调节。
　　测定方法：选用标准微量二倍稀释法向96孔V型板上第一孔自上而下依次加入各种药物60微升，吸取10微升菌液于平皿中用蒸馏水按1：1000稀释，用彩色8ch微量移液器吸取平皿中配好的菌液60微升加入第一孔中，第一孔混合均匀后吸出60微升加入第二孔中，用同法依次二倍稀释至第11孔，第12孔做阳性对照。则各管的浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25微克/毫升，置于37℃培养18小时，然后观察结果，以无细菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度。

　　2.舒巴坦对氟喹诺酮类药物抗菌活性的影响

　　抗生素原液的配制：将氟喹诺酮类药物与盐酸左氧氟沙星、甲替沙星、乳酸环丙沙星分别按2：1配伍，配制成复方药，可在无菌操作下用无菌蒸馏水溶解和稀释，配制成体积为10毫升的抗生素原液，分装小瓶，在4℃冰箱中保存，可用一周。

　　被测菌株悬液的制备： 在无菌操作下，用接种环挑取麦康凯培养基中生长较好的菌落接种于GN增菌液中，置37℃恒温箱中过夜培养。
　　菌液稀释: 将上述菌液用MH肉汤作10000倍稀释。

　　最小抑菌浓度（MIC）测定：把筛选出来的多重耐药菌株用GN增菌液37℃过夜培养，再用MH肉汤作10000倍稀释，其它方法同上述MIC实验的方法。

--------------------------------------------------------------------------------

二、结果与分析

　　（一）多重耐药菌株的筛选结果

　　9种抗菌药对鸭大肠杆菌的MIC结果见表1，鸭大肠杆菌对9种抗菌药物的耐药率测定结果见表2。

表1  9种抗菌药对鸭大肠杆菌的MIC结果

　　由表1可以看出，舒巴坦能使头孢曲松对产酶菌株的抗菌活性显著增强，但不能增强不产酶菌株的抗菌活性，因为舒巴坦钠是β-内酰胺酶抑制剂，可抑制细菌所产生的β-内酰胺酶对抗生素的水解或灭活。

表2  鸭大肠杆菌对9种抗菌药物的耐药率测定结果

（单位：微克/毫升）

　　通过表2的判断标准，可以看出YC1、YC3、YC4、YC5是多重耐药菌株。由表2可知氟喹诺酮类、氨基糖苷类、头孢类的耐药性不同，氟喹诺酮类除了克林沙星的耐药率是16.7%，其它药物的耐药率均不小于50%，氨基糖苷类的耐药率要比头孢类的耐药率大。实验所挑选出来的4株菌都是产酶菌株，会产生灭活酶使细菌产生耐药性，可用舒巴坦钠排除这个干扰，对于产酶菌，通过对比耐药率标准筛选出YC1、YC3、YC4、YC5为多重耐药菌株。

（二）舒巴坦对氟喹诺酮类药物抗菌活性的影响（见表3）

表3  舒巴坦对喹诺酮抗菌活性的影响结果（单位：微克/毫升）

　　 由表3可知，舒巴坦对氟喹诺酮类药物的抗菌活性有增强作用，除了舒巴坦能使环丙沙星对YC1的抗菌活性增强8倍外，其它均能使氟喹诺酮类药物对所筛选出来的多重耐药菌的抗菌活性增强2倍。

--------------------------------------------------------------------------------

三、试验总结

　　1.本实验通过对多重耐药菌的筛选，共选出4株多重耐药菌株，比较头孢曲松钠对不同菌株的MIC值可知，不产酶的6株菌株对头孢曲松钠都是极度敏感的。并不是所有的产酶菌都是多重耐药菌，所谓对三类抗生素产生耐药性并非要对这三类抗生素中的所有药物全部产生耐药性，只需对大部分药物产生耐药性即可判定为多重耐药。

　　2.细菌产生耐药性的机制主要是产生灭活酶、改变靶位结构、降低细胞膜的通透性、改变代谢途径、主动转运泵作用，本实验检测的产ESBLs鸭大肠杆菌呈多重耐药特性，一是鸭大肠杆菌携带ESBLs的质粒，同时携带有氟喹诺酮类等多种抗菌药的耐药基因，使产ESBLs菌具有多重耐药表型；二是产生ESBLs等特异性耐药机制与外膜通透性降低、主动外排作用等非特异性耐药机制协同存在导致了多重耐药。舒巴坦是一个具有特异性和不可逆性的β-内酰胺酶抑制剂，本身虽几乎无抗菌作用，但与β-内酰胺类抗生素联用能明显提高对产酶耐药菌的体外抗菌活性。

　　而且本实验表明舒巴坦不仅能够增强第三代头孢菌素类抗生素对产ESBLs鸭大肠杆菌的抗菌活性，也能明显提高氟喹诺酮类药物的抗菌活性，其原因可能是当用舒巴坦抑制ESBLs后，膜通透性改变、主动外排的作用亦相应减弱，从而使药物对产ESBLs鸭大肠杆菌的抗菌活性相应增强，其具体分子机制值得深入探讨。
参考文献略

      作者简介：刘保光，(1983-)，男，在读硕士研究生，主要从事于兽药药理学研究