猪传染性胸膜肺炎主要感染育肥猪，看看我国那些地区流行！

　　猪传染性胸膜肺炎( Porcine Contagious Pleuropneumonia, PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)引起的一种以急性出血性纤维素性胸膜肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜肺炎为特征的高度接触性呼吸道传染病。该病发病率和死亡率常在20%以上，最急性型的死亡率可高达80%～100%。目前胸膜肺炎放线杆菌已经分离出15种血清型，毒力因子多，各血清型之间交叉免疫保护率低，诊断和防治有一定困难。

　　自1957年猪传染性胸膜肺炎被发现以后，现已在世界许多国家和地区流行，成为严重危害养猪业的重要细菌性传染病之一。从20世纪90年代后期，随着我国集约化和规模化养猪业的发展，该病在我国的流行趋势越发明显。王建新等对海南省11个规模化猪场的608份血清进行了检测，发现APP的感染率高达82.2%。姚四新等对来自河南省新乡市的8个不同规模养猪场的106份血清进行APP检测，证实APP的阳性率为33.02%，感染率为9.1%～58.8%。徐公义等对鲁西地区186头病死猪和545头无临床症状的健康猪进行了APP的流行病学检测，结果发现，186份病料中APP的阳性率占43.0%，545份猪血清中APP的阳性率为7.9%。邓灶福等对湖南不同地区的267份猪血清进行APP检测，结果阳性率为34.46%。由以上报道可知，APP已经在我国大部分地区存在。

　　本次研究的重点在于调查猪传染性胸膜肺炎在我国某些地区流行的情况，更好地掌握其流行的规律，探索有效的防控措施，改善养猪场的管理模式以及发病后的治愈方法，从而降低该病的发病率和死亡率，严格控制该病的流行，减少因该病引起的损失。

　　1、材料

　　1 187份血清样品(来自湖北15个猪场的768份血清、湖南1个猪场的80份血清、四川1个猪场的126份血清、广东1个猪场的74份血清、山东1个猪场的99份血清、福建1个猪场的40份血清)。

　　277份血清样品(来自湖北2个猪场的178份血清、福建1个猪场的40份血清、山东1个猪场的59份血清)，其中包括仔猪、育肥猪、种猪，要求血清清亮，无溶血。

　　血清型1～13(无2、8)型的标准APP菌株、阴阳对照血清。

　　氯化钠、琼脂粉、硫柳汞、电子称量台、湿盒、培养管、超净台、恒温箱。

　　猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-ELSA抗体检测试剂盒(由某动物生物制品有限责任公司提供)。

　　2、方法

　　2.1琼脂扩散试验方法

　　(1)APP的复苏培养：将胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)加入到11个培养管(20 mL/管)中，每管5 mL，并加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，将各种血清型的APP菌株与甘油混合液(体积比1∶1)从-80℃冰箱中取出，每个培养管100 μL，放入到37℃培养箱中培养24小时。如果24小时后培养管浑浊就表明APP生长良好。

　　(2)酚水抗原的制备：从培养管取出APP的24小时培养物，溶解在适量PBS中，以5 000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，菌体沉淀用PBS洗两次。菌体沉淀用适量的68℃蒸馏水稀释。充分混匀后加入等体积、同温度的90%酚，在68℃水浴锅中水浴20分钟，每过2分钟取出，上下搅拌混匀。水浴结束后立即取出，冷却冰浴10分钟，然后再在4℃离心机中以7 500 转/分钟离心20分钟，取水相;再重复上一次做法，再加入上次同量的68℃蒸馏水，水浴、搅拌、冰浴、取水相。将两次取出的水相混合就是酚水抗原。

　　(3)琼脂凝胶板的制备：按照每100 mL蒸馏水含8.5 g氯化钠、1.0 g琼脂粉、0.1 g硫柳汞配置。取所需材料量在微波炉中用沸水融化，按照制板分装。待冷却后用打孔器打孔，孔径5 mm，孔距5 mm，孔深3 mm。再稍微用酒精灯烘烤底面，使其底面琼脂与玻璃板粘连紧密以防止加样渗漏。

　　(4)加样：按照所需在孔中加入抗原和待测血清(原待测血清用PBS稀释4倍后)，中间孔加各种APP血清型的抗原(或待测血清)，周围孔加入待测血清(或抗原)，设置阴、阳性对照孔，每孔加满为宜，但不要溢出。

　　(5)加样好的琼脂板放入湿盒中，再将湿盒放入37℃恒温箱中，放置24小时后观察结果。

　　(6)中央孔加酚水抗原，周围孔加入待测血清，24小时温育后，阳性反应即待测血清和抗原之间会出现一条白色的特异沉淀线，该沉淀线会靠近抗原孔。血清型1、9、11型之间，血清型3、6之间，为了消除非特异性沉淀线的干扰，可以在有交叉反应的血清中加入非对应的血清型菌体，在37℃中震荡吸收2小时，以7 000 转/分钟离心15分钟除去菌体，如果吸收完全，可以去除非特异性沉淀线。例如血清型1型血清用血清型9型菌体吸收后，可以消除交叉反应。也可以通过白色沉淀线的清晰度来辨认非特异性和特异性沉淀线。

　　2.2 ApxⅣ-ELISA试验方法

　　严格按照检测试剂盒说明书进行试验。

　　(1)稀释样品：在血清稀释板中按照1∶40的体积稀释待检血清，195 μL样品稀释液中加入5 μL待检血清样品。对照组稀释：在血清稀释板中按照1∶4分别稀释阳性对照和阴性对照血清，180 μL样品稀释液中加入60 μL对照血清。

　　(2)取抗原包被板，将稀释好的待检血清、阳性对照和阴性对照血清各取100 μL加入到抗原包被板中，待检血清设1孔，阳性对照、阴性对照血清各设2孔。轻轻振动样品，使其充分混匀，放置在37℃下温育30分钟。

　　(3)温育后，甩掉板孔中的液体，用洗涤液洗板5次，每次200 μL，每次静置3分钟后倒掉洗涤液，并在干净吸水纸上拍干。

　　(4)每个孔加入羊抗猪酶标二抗100 μL，放置在37℃下温育30分钟。

　　(5)温育后洗涤5次，方法同步骤(2)。

　　(6)每个孔加入底物A和底物B各1滴(约50μL)，混匀后，放置在室温下(20～25℃)避光显色10分钟。

　　(7)每个孔加入终止液1滴(约50 μL)，10分钟内测定结果。

　　结果判定：在酶标仪上测各孔的OD630 nm值。试验成立的条件是：阳性对照孔OD630nm值均≥0.6;阴性对照孔OD630 nm值均<0.3。如果N(待检样品孔OD630 nm值)≥M(阳性对照孔平均OD630nm值)×0.25，判定为阳性;如果N